跳动城乡网自1950年代以来，研究人员一直使用华莱士·库尔特发明的著名方法“流式细胞术”来表征研究中和人类血液样本中的不同类型的免疫细胞。这不仅使人们能够更深入地了解免疫细胞的发育，还为评估人类健康和诊断各种血癌提供了新方法。后来，流式细胞术也应用于其他细胞类型。
在传统的流式细胞术中，使用与荧光探相连的抗体分子来检测细胞表面和细胞内的蛋白质。然而，虽然这种方法具有单细胞灵敏度，但它在检测多种蛋白质方面受到荧光团数量的限制，因为荧光团的数量在整个荧光光谱中可以清晰区分。
2009年，“质谱流式细胞术”的出现使单细胞中50种蛋白质同时定量成为可能，并能更细致地分析细胞身份和生理状态。在质谱流式细胞术中，抗体与金属元素的非放射性同位素相连。这些同位素可根据其质量在质谱流式细胞仪的不同通道中进行定量。
然而，与流式细胞术和荧光显微镜相比，质谱流式细胞术及其同类技术“图像质谱流式细胞术”(IMC)用于可视化完整组织切片中的细胞蛋白，但其灵敏度却有所降低。
如今，又过了15年，由哈佛大学Wyss研究所牵头、麻省理工学院和多伦多大学研究人员参与的研究合作，开发出一种利用DNA纳米技术显著提高质谱流式细胞术和IMC灵敏度的方法。他们将一种名为“循环延伸扩增”(ACE)的新型信号放大技术应用于与抗体相连的DNA条形码，能够将抗体结合金属同位素产生的蛋白质信号放大500倍以上，并同时高灵敏度地检测30多种不同的蛋白质。
新方法使他们能够定量检测稀有蛋白质，研究复杂的生物组织变化，并研究调节免疫细胞功能的整个互连蛋白质网络如何响应刺激和病理条件。ACE应用于IMC，还可以识别组织切片中的细胞类型和组织区室，以及与多囊肾病病理相关的组织组织变化。
该研究结果发表在《自然生物技术》杂志上。
“ACE有助于弥补流式细胞分析中的一个关键空白：通过提高质谱流式细胞术的灵敏度，它使单细胞分析平台能够同时实现高灵敏度、高复用和高通量。它为使用高度复用和灵敏的方法研究悬浮液和完整组织中的单细胞提供了机会，可以更深入地了解正常和病理生物学过程，”领导这项研究的Wyss研究所核心教员PengYin博士说。Yin还是哈佛医学院(HMS)系统生物学系的教授。
DNA越多，金属同位素越多，灵敏度越高
此前，尹和他的Wyss研究所团队已经开发了多种DNA驱动的成像技术，这些技术可以在单分子水平上以超高分辨率揭示细胞内部的运作方式，或者通过在单个组织切片中可视化许多不同的RNA和蛋白质分子。但使用这些方法创建的DNA结构没有足够的弹性来承受质谱流式细胞术中使用的相对恶劣的条件。
“ACE解决了目前质谱流式细胞术的灵敏度问题，它允许研究人员将抗体分子与数量显著增加的金属同位素相关联，而传统质谱流式细胞术则无法实现。这大大促进了对大量低丰度蛋白质的定量分析，而这在以前的单细胞方法中一直是一个难题。”共同第一作者、Yin团队的博士后研究员Xiao-KangLun博士说道。Lun与共同第一作者KuanweiSheng博士合作开展了该项目，后者最初开发了ACE用于其他应用，包括多路复用成像，他也是Yin的博士后研究员。
盛教授表示：“我们受到前期引物延伸反应(用于制备线性DNA串联体(串联连接的相同DNA序列的多个副本)和PCR反应(通过同步热循环实现扩增)研究的启发，发明了ACE，通过热循环以可控的方式原位合成线性串联体。”
ACE为携带金属同位素的短“检测链”创建了一个具有多个结合位点的支架。此外，通过分支支架链的合成，研究人员可以进一步提高该方法对稀有蛋白质检测的灵敏度。线性ACE平均提供13倍的信号放大，而分支ACE允许最初未放大的信号增加500倍以上。
为了稳定整个ACE序列复合物并在质谱流式分析过程中保持其完整性，他们用化学交联剂将支架和添加的检测链之间形成的短双链交联。
“按照这个方案，我们设计了一个包含33个可区分(直系同源)ACE序列的面板，这些序列的合成不会互相干扰，并将其应用于三种完全不同类型的分析，”同时也是Yin团队的博士后研究员的Sheng说道。
ACE增强了基于IMC的多参数组织分析。图片来源：NatureBiotechnology(2024)。DOI：10.1038/s41587-024-02316-x
工作中的ACE
研究团队首先利用ACE研究上皮细胞转变为间质细胞并再次转变为上皮细胞的过程。上皮-间质转变(EMT)和间质-上皮转变(MET)发生在胚胎发育过程中，但前者在肿瘤具有侵袭性和转移性时也会重新出现。
通过对单个小鼠乳腺癌细胞从上皮状态到间质状态再返回的28天转变过程中总共32种上皮和间质标志物、信号分子和稀有转录因子进行多次分析，并通过计算分析结果，他们能够对这两个过程提供新的见解。
“ACE使我们能够同时分析低丰度转录因子的水平以及反映单细胞中细胞生理和信号状态的标记。这让我们能够更精确地了解EMT和MET中的分子程序是如何通过增加和减少关键转录因子(包括Zeb-1和Snail/Slug)的数量来驱动的，”Sheng说。
在第二个例子中，他们深入研究了单个T细胞的内部工作原理。刺激其表面的T细胞受体(TCR)分子会导致复杂的细胞内信号蛋白网络激活。由于T细胞体积小，以单细胞分辨率分析这些信号反应一直很困难。该网络中的单个蛋白质由磷酸残基激活，这些残基由通常称为激酶的其他网络蛋白质附着在它们身上。
许多这些激活的网络蛋白会继续磷酸化网络中的其他蛋白。这最终会导致T细胞行为发生变化，例如对病原体或癌细胞的行为。研究人员将ACE应用于一组30种抗体，这些抗体特异性地与TCR网络蛋白中的磷酸化基序结合，这些蛋白在压力、炎症、细胞增殖和其他反应中发挥作用。
“利用ACE增强质谱流式细胞术分析，我们捕捉到了单个原代人类T细胞中动态变化的TCR网络的定量快照。这使我们能够研究特定T细胞激活事件的时间和持续时间的单细胞变化，并揭示网络如何通过细胞外线索从基态激活，”Lun说。
研究小组使用相同的ACE增强抗体组来研究一种被称为“损伤诱发的T细胞麻痹”的现象。T细胞在其环境中受到损伤，例如在大型外科手术中造成的组织损伤，通常会产生免疫抑制作用。
为了开始了解TCR网络是如何导致这种情况的，Yin的团队与合著者MichaelYaffe博士合作，他是麻省理工学院的DavidH.Koch科学教授和生物学与生物工程教授，对组织损伤部位周围的微环境如何抑制免疫系统有着浓厚的兴趣。Yaffe为团队提供了从接受手术的患者身上获得的“术后引流液”(POF)样本。用POF及其TCR刺激T细胞使研究人员能够分离出导致单个T细胞停止分裂并变得疲惫的独特网络变化。
最后，他们研究了ACE在利用IMC对组织切片中的蛋白质进行空间分析方面的实用性，重点研究了人类肾脏。肾脏组织很难通过荧光显微镜进行分析，因为它具有很强的自发荧光，而传统的IMC则缺乏灵敏度。
研究人员开发了一组20种ACE增强抗体，用于检测各种肾脏标志物，并用它来检查多囊肾病患者的肾皮质切片。他们与合著者、加拿大多伦多大学教授、多路复用成像专家HartlandJackson博士合作，通过这种方法，他们能够识别肾脏近端和远端小管、集合管和血液过滤肾小球内的不同细胞类型及其组织。
Lun表示：“我们发现了细胞和组织结构中新的疾病特异性特征，并发现干细胞标记物Nestin(也与肾脏疾病有关)在肾小球中的表达非常不均匀。这可能意味着组织的不同部分可能同时经历不同的病理阶段。”
“PengYin团队及其合作者开发的这种新型质谱流式细胞术方法再次展示了利用DNA纳米技术增强现有技术的强大功能，这种技术与临床护理密切相关，并且灵敏度和特异性更高。这种相对简单的方法将带来对细胞、组织和器官功能的全新见解，无论是在健康期间还是疾病期间，”共同资深作者、Wyss创始董事DonaldIngber医学博士、哲学博士说道，他的团队在刺激T细胞方面提供了关键专业知识。他还是哈佛医学院和波士顿儿童医院的JudahFolkman血管生物学教授，以及哈佛大学JohnA.Paulson工程与应用科学学院的HansjörgWyss仿生工程教授。
